초기배아를 비롯하여 세포나 조직, 개체 등과 같은 생물학 적 재료를 형태와 기능적인 변화가 일어나지 않은 상태로 저 온에서 장기간 보관하고, 필요한 시기에 융해하여 동결보호제 (cryoprotective agents: CPAs)를 제거한 후, 세포의 발달이 계 속 이뤄질 수 있는 생리적 환경상태로 되돌리는 과정을 동결보 존(cryopreservation)이라 한다(Yoon et al., 2007). 초기배아의 냉동에 관한 연구는 Whittingham 등(1972)은 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 사용하여 완만 동결과 완만 융해의 방법으로 생쥐 배아를 빙결점 이하의 온도에서 장기간 동결보존에 성공하여 산자를 탄생시킨 이후, 토끼(Siebzehnruebl et al., 1989), 햄스 터(Todorow et al., 1989), 양(Szell et al., 1990) 등에서도 잇달 아 보고되었다. 인간에서는 Trounson과 More(1983)가 동결보 호제로 DMSO를 냉동방식으로 —80℃까지 매 분당 —0.3℃씩 하강시키는 완만동결방법(Al-Hasani et al., 1987; Fehill et al., 1985; Siebzehnruebl et al., 1989; Todorow et al., 1989; Whittingham et al., 1972)을 2세포기 배아에 사용하여 첫 번째 임신 을 보고하였으며, 뒤이어 1984년에는 Zeilmarker et al.(1984)이 동일한 동결보호제로 —40℃까지 완만동결하는 방법을 8세포 기 배아에 적용함으로써 임신 및 분만에 성공하였다. 그 이후 Lassalle et al.(1985)은 동결보호제로 propandiol(1,2-PROH)에 sucrose를 첨가하여 사용함으로써 동결온도를 —30℃까지만 감 소시키고, 시간도 줄일 수 있었다. 또한 Cohen et al.(1985)은 glycerol로 배반포를 동결보존한 후 임신에 성공하였다. 이와 같은 초기 배아의 동결보존 기술은 가축을 포함한 대동물과 인 간에게도 적용되어 그 가치가 증가되고 있으며, 이러한 초기배 아의 동결보존은 세포의 체외배양(in vitro) 연구에 없어서는 안 될 중요한 과정으로 인식되고 있다. 최근에는 여러 동물에서 상 업적 이용이 가능하게 되었으며, 인간의 체외수정(IVF) 프로그 램 분야에 접목되어 그 중요성이 점점 커지고 있다(Whittngham et al., 1972; Hamberger and Hazekamp, 2002).

동결 보존 후, 초기배아의 생존율에 있어 동결 방법만큼이 나 중요한 것은 동결 및 융해 과정 중에 사용되는 동결보호제 의 종류, 농도 및 처리 시간이다(Friedler et al., 1988; Mandelbaum et al., 1988; Nowshari et al., 1995). 기존에는 독성이 강 하고 점성이 높은 침투성의 동결보호제로서 DMSO, glycerol 그리고 1,2-PROH를 사용하였다. 그러나 최근에는 Martino 등 (1996)은 소 성숙난자를 ethylene glycol(EG)을 사용하여 높은 배반포율을 보고한 것과 같이 낮은 분자량과 높은 침투능력 (Gilmore et al., 1995) 그리고 비교적 독성이 적은 특징이 있 는 EG을 사용하는 빈도가 점차 높아지고 있으며, 비침투성 동 결보호제로는 dextran, raffinose, 난황, 혈청 알부민이 있으나, glucose와 sucrose를 가장 많이 사용하고 있다(Kim et al., 1996; Rayos et al., 1994; Zhu et al., 1993). 그러나 동결보호제의 독 성 또한 세포에 손상을 줄 수 있기 때문에 신중히 사용해야 한 다. 동결보호제의 독성은 크게 화학적 독성과 삼투압적 상해로 나눌 수 있다(Newton et al., 1999). 생식 세포에 미치는 동결보 호제 독성은 아직까지도 밝혀지지 않은 것들이 많다. 세포막의 투과성, 표면적과 부피 등 세포에 물리적인 손상을 주게 되며, 또한 동결 및 융해의 방법과 처리액에 따라 그리고 배아의 발 생시기와 배아의 질에 따라 생존율이 영향을 받게 된다. 그러 므로 본 연구에서는 생식세포 동결에 가장 흔히 쓰이고 있는 침투성 동결보호제(DMSO, EG, Glycerol 그리고 1,2-PROH) 의 독성을 서로 비교하고자 생쥐 수정란 모델을 이용한 실험을 하였다. 네 개의 동결보호제 간의 독성의 확립을 위해 생쥐 2- 세포기 배아를 장기간 (60분) 동결보호제에 노출시킨 후, 포배 기까지 배 발생을 시키면서 나타나는 세포사멸의 정도와 배 발 달 지연현상을 조사하였다.

배양액은 glutamine(0.1 mM/ml)이 포함된 KSOM(Lawitts and Biggers, 1993)을 사용하였고, 침투성 동결보호제의 비교 대 상인 DMSO, EG, 1,2-PROH 그리고 Glycerol은 1.5 M Leibovitz- L15(Gibco BRL, UK)를 기본배양액으로 사용하였다. 모든 배양 액은 0.5% antibiotics(Streptomycine sulfate, S-9137; Penicillin- G, P-3032, Sigma, USA)를 첨가한 다음, 삼투압 측정기(Osmomat 030, Gonatec, German)를 이용하여 삼투압을 280 mOsmol/kg으 로 보정하였다. 삼투압을 보정하고 나서 0.2 μm의 여과기(Minisant 17597, Sartorius, Germany)로 제균하면서 14 ml tube (2001, Falcon, USA)에 분주한 다음 4℃에서 보관하였다. 배양액은 95 % 이상의 습도, 37℃ 및 5% CO₂를 유지하고 있는 배양기(3154, Foma, USA)에서 6시간 이상 평형시킨 다음 이용하였다. 본 실 험에 이용된 그 외 시약들은 Sigma(St Louis, Mo, USA)사 제 품을 구매하여 사용하였다.

2-세포기에서 얻은 수정란을 실온에서 60분 동안 동결보호 제에 노출한 후, 배양기로 옮겨 24시간 주기로 배반포 발생시 까지 배 발달율을 관찰하였다. 96시간 동안 배양하여 형성된 배반포는 bis-benzimide(Hoechst 33342)로 염색하여 세포수를 계수하여 배 발달율을 조사하였다. 동결보호제에 노출시킴으로 써 나타나는 배 발달율에 미치는 영향을 알아보고자 PMSG 주사 후 96시간을 기준으로 세포수가 50개 미만은 A군, 50∼80개 미만은 B군으로, 80개 이상인 C군으로 나누어서 분석하였다.

핵을 염색하기 위하여 bis-benzimide를 10 μg/ml로 희석하 여 빛이 차단된 곳에 배아를 5분간 처리한 후, 0.3% BSA가 함 유된 PBS로 3회 이상 세척한 후, 배아를 slide glass위에 mounting한 후, 형광현미경을 이용하여 관찰하였다.

본 시험에서 얻어진 모든 자료들의 통계 분석은 Statistical Analysis System(SAS release ver. 8.2, 2002)의 General Linear Model(GLM) procedure를 이용하여 분산분석을 실시하였고, 처 리구 간에 유의성은 Duncan’s multiple range-test(Duncan, 1955) 를 이용하여 5% 수준에서 검정하였으며, 각 요인들의 상관관 계의 유의성 검정은 Pearson’s correlation coefficient를 활용하 였고, P값이 0.05보다 낮은 경우를 유의하다고 정의하였다.

배 발달율은 대조군에서 92.0%가 정상적으로 발달하였으며, DMSO 처리군에서는 A군이 12.3%, B군이 33.8%, C군이 53.9 %로, EG 처리군에서는 A군이 7.7%, B군이 29.2%, C군이 63.1 %로, Glycerol 처리군에서는 A군이 11.1%, B군이 30.1%, C군 이 49.5%로, 1,2-PROH 처리군에서는 8.6%, 31.2%, 65.9%로 각각 나타났다. Fig. 1과 같이 정상 배 발달율은 대조군보다 동 결보호제 처리군(DMSO, EG, Glycerol, 1,2-PROH)에서 유의 하게 낮게 나타났으나(p<0.001), 처리군 간에는 통계적인 차이 가 없었다. 특히, Glycerol 처리군에서 C군(30.1%)이 다른 군에 비해 가장 낮은 비율을 냈다(p<0.001). 24시간 주기로 배 발달 율을 확인해 본 결과, 동결보호제 처리군(DMSO, EG, Glycerol, 1,2-PROH)처리군 모두 대조군에 비해 배발달의 속도가 늦은 것으로 나타났다(Fig. 2). 특히, 부화시기인 배양 4일째의 경우, 처리군 중 DMSO와 Glycerol의 두 처리군에서 유의하게 낮은 부화율이 관찰되었다(p<0.001).

Figure 1.

Comparison of embryo development after 60 minutes exposure of 2-cell murine embryo to 1.5 M DMSO, 1.5 M EG, 1.5 M Glycerol and 1.5 M 1,2-PROH. Data represent mean ± S.D.; a: p<0.001 versus control; Cell number A: <50, B: 50∼80, C: >80.

Figure 2.

Comparison of hatching rates of embryos that were exposed to cryoprotectants at the 2-cell embryo stage. Data represent mean ± S.D.; a: p<0.001 versus control.

배반포 세포 수는 DMSO 처리군(65.0±13.0)과 EG 처리군 (81.1±15.1), Glycerol 처리군(62.1±27.0), 1,2-PROH 처리군(88.0 ±21.1) 모두 대조군(99.9±21.3)에 비해 유의하게 적게 나타났다 (p<0.0001). 처리군 간에는 DMSO와 Glycerol 처리군이 1,2- PROH와 EG 처리군에 비해 유의하게(p<0.05) 적게 나타났고, EG와 1,2-PROH 처리군 간 그리고 DMSO와 Glecerol 처리군 간에는 유의적인 차이는 없었다(Fig. 3).

Figure 3.

Comparison of total cell number of murine blastocysts which were treated with 1.5 M DMSO, 1.5 M EG, 1.5 M Glycerol and 1.5 M 1,2-PROH, and Leibovitz solution (control) at the 2-cell embryo stage. Data represent mean ± SEM; a: p< 0.001 versus control, b: p<0.05 versus DMSO.

세포사멸된 세포수를 분석한 결과에서도 DMSO 처리군(14.7 ±1.3), EG 처리군(12.1±1.1), Glycerol 처리군(15.2±1.8)과 1,2- PROH 처리군(11.5±1.3) 모두 대조군(6.5±0.7)에 비해 유의하게 높게 나타났으며(p<0.001), 처리군 간에는 DMSO와 Glycerol 처리군이 EG와 PROH 처리군에 비해 유의하게(p<0.001) 세포 사멸된 세포의 비율이 높은 것으로 나타났다(Fig. 4).

Figure 4.

Comparison of the apoptotic rates of cells in blastocysts which were treated with 1.5 M DMSO, 1.5 M EG, 1.5 M Glycerol and 1.5 M 1,2-PROH for 60 min at the 2-cell embryo stage. Data represent mean ± SEM; a: p<0.001 versus control, b: p<0.01 versus DMSO.

포유류 및 인간배아의 동결보존 과정에서 성공률에 영향을 주는 요인들로는 동물의 종, 동결 시 배아의 발달단계와 배아의 형태(Lassalle et al., 1985; Wilmut, 1972), 동결 및 융해 속도 (Polge et al., 1949; Wilmut, 1972), 동결보호제의 선택(Polg- Wilmut, 1972) 등을 들 수 있다. 이처럼 배아가 동결 및 융해과 정에서 가능한 손상을 입지 않도록 하기 위한 연구가 활발히 이루어져오고 있으나, 이에 대한 견해는 연구자들 간에 다양한 실정이다. 동결보호제의 기능에는 속일성의 효과(Whittingham et al., 1980), 세포막의 안정화(Renard et al., 1984) 그리고 반 응성 수산기의 제어 등이 있다고 잘 알려져 있다. 한편, 동결 보호제의 독성은 세포막 지질의 용해와 단백질 변성 등에 의 해서 나타날 가능성이 생각된다. 하지만 정확한 본질에 대해 서는 알려지지 않은 점들이 너무 많다.

Mahadevan와 Miller 등(1997)은 37℃에서 1,2-PROH에 노출 된 경우는 실온에 비해 배반포의 형성이 상당히 감소하고, 37 ℃에서 5분 이상 전핵기 수정란을 동결보호제에 노출하면 초 기배아의 발달이 감소한다고 보고했다(Mahadevan and Miller, 1997). 이와 같이 동결보호제의 독성은 화학 약품들의 고유 특 성들뿐만 아니라, 노출기간과 온도와 상당히 밀접한 관련성이 있다. 또한 Takagi 등(1993)은 소 배아의 동결실험을 통해서 동결보호제의 독성은 노출 시간과 밀접한 관련이 있으며, 비례 한다고 보고하였다(Takagi et al., 1993). 실온에서 60분 동안 EG에 노출시키면 원시난포(primordial follicles)의 생존율이 감 소되었다는 보고가 있다(Candy et al., 1997; Cohen et al., 1985). 이런 연구결과의 보고들을 종합해 생각해 보면 다양한 세포들 로 이루어진 조직들이 온도의 평행에 도달하기 위해서는 더 긴 노출 시간이 필요하고, 결과적으로 조직에 대한 동결보호제 독 성의 위험성이 증가될 것으로 사료된다. 본 연구는 생식세포 동결에 가장 흔히 쓰이고 있는 침투성 동결보호제(DMSO, EG, Glycerol, 1,2-PROH)의 독성을 서로 비교하고자 생쥐 수정란 모델을 이용해 포배기까지 배아 발생을 시키면서 나타나는 세 포사멸의 정도와 배아 발달 지연현상을 비교 및 검토하였다. 초기배아세포의 동결보호제 60분 노출 결과, 침투성 동결보호 제(DMSO, EG, Glycerol, 1,2-PROH) 처리군과 대조군 사이에 는 배아 부화율에 차이가 확인되었으며, 이는 배아에 대한 동 결보호제의 잠재적인 독성을 확인한 결과였다. 이번 연구에서 장기간 처리했을 경우 EG와 1,2-PROH 처리군보다 DMSO와 Glycerol 처리군에서 배아발달과 세포수가 각각 저하된 결과들 로부터 DMSO와 Glycerol의 독성이 1,2-PROH와 EG보다 독 성이 더 높을 것으로 사료되며, 이전의 연구 결과(Mahadevan and Miller, 1997; Demici et al., 2001)와도 일치하는 것을 확인 했다.

일반적으로 세포는 세포주기에 따라 체크포인트를 두어 내 재적인 결함 등을 치유 및 회복하는 기전(Demici et al., 2001) 을 가지고 있는 것으로부터 부화지연 현상은 동결보호제의 독 성을 배아 세포가 극복하는 시간 차이를 나타낼 가능성이 사 료된다. EG와 1,2-PROH 처리군과 DMSO와 Glycerol 처리군 간의 부화율을 비교해 보면 EG와 1,2-PROH이 유의적으로 높 은 것으로 나타나는데, 이는 초기 배아 발달단계에서 DMSO 혹은 Glycerol 처리군에서는 상해를 입은 배아는 포배기까지 상해를 입은 상태로 존재하는 반면에, EG와 1,2-PROH 처리군 에서는 시간이 경과함에 따라 발생이 재개되어 부화까지 도달 하는 것으로 추정할 수 있다. 또한 전반적인 배아 발달 양상 을 보면 DMSO와 Glycerol 처리군에서 부화된 배아보다 팽창 포배의 수가 많은 것으로 관찰되었으며, 이는 부화에 관여하 는 기전에도 동결보호제가 영향을 미칠 가능성이 사료된다.

아직까지 동결보호제의 독성에 대해 많은 부분이 밝혀지지 않고 있으므로 동결보호제의 독성을 알아보는 연구가 추가되 어야 할 것으로 생각된다. 특히, 생식 세포(germ cells)에 대한 성장과 발달에 있어서 저해 효과를 최소화 할 수 있도록 분자 수준에서의 비치사성 동결보호제 손상을 밝힐 필요가 있다고 생각된다. 또한 동결보호제의 알려지지 않은 독성을 감소시키 기 위해서 가능하면 동결보호제에 노출되는 시간을 최소화하 는 것이 중요하다고 사료된다.

본 연구에서 배아의 생식세포 동결에 가장 흔히 쓰이고 있 는 침투성 동결보호제(DMSO, EG, Glycerol, 1,2-PROH)의 독 성을 비교하고자 생쥐 수정란 모델을 이용한 실험을 하였다. 생후 6주령의 암컷 생쥐 F1 hybrid mice에 10 IU의 PMSG를 복강 주사하여 과배란을 유도하고, 2-세포기 배아를 획득하고 침투성 동결보호제(DMSO, EG, Glycerol와 1,2-PROH) 각각 실 온에서 60분간 노출시킨 후, 배양을 하였다. 배반포의 전체 세 포수는 2-세포기 단계에서 DMSO(68.1±24.1), EG(68.1±24.1), Glycerol(81.2±27.0), 1,2-PROH(68.1±24.1) 침투성 동결보호제 처리군은 대조군에 비해 유의적으로(99.0±18.3)(p<0.001) 낮았 다. DMSO와 Glycerol 처리구가 EG와 1,2-PROH 처리구에 비 해 세포수가 적었다. DMSO(15.4±1.5), EG(10.2±1.4), Glycerol (10.2±1.4), 1,2-PROH(10.2±1.4) 네 처리구는 대조구(6.1±0.9, p<0.0001)와 비교해서 배반포에서 세포사 비율이 더 높음을 확 인했다. 또한, DMSO와 Glycerol 처리구는 EG와 1,2-PROH 처 리구(p<0.001)보다 더 많은 세포사멸된 세포가 각각 확인되었 다. DMSO, EG, Glycerol과 1,2-PROH 처리군과 대조군 사이 에는 배아 부화율에 있어서 차이가 있었으며 이는 배아에 대한 동결보호제의 잠재적인 독성을 확인한 결과였다. 이번 연구에 서 장기간 처리했을 때 EG와 1,2-PROH 처리군보다 DMSO와 Glycerol 처리군에서 배아발달과 세포수가 저하된 것은 DMSO 와 Glycerol의 독성이 더 높을 것으로 사료된다.

(중심 단어: 동결보존, 생쥐 배자, 독성, 침투성 동결보호제, DMSO, EG, Glycerol, 1,2-PROH)